Analyse & purification des protéines : tout sur la chromatographie par affinité

Suite de notre série d’articles sur les techniques de purification des protéines : en Février 2020, nous vous avions présenté la technique IEX- Chromatographie par Échange d’Ions, aujourd’hui, cet article traite de la chromatographie par affinité.

Cette technique est la plus performante dans la mesure où, grâce à elle, nous obtenons des protéines pures à 90 %.
Il existe plusieurs chromatographies par affinité : affinité sur Protéine A, affinité IMAC (Immobilized Metal Affinity Chromatography), affinité GST-Tag…

La chromatographie par affinité

La chromatographie par affinité permet la séparation sélective de biomolécules actives et l’isolement de leurs formes inactives ou dénaturées.
La séparation se fait par interactions spécifiques entre un ligand immobilisé et son partenaire (anticorps/antigène, enzyme/substrat, enzyme/inhibiteur, Protéine His Tag/métal…

Avantages

• Excellente sélectivité, grande pureté 80 – 90%
• Purifications en 1 ou 2 étapes
• Concentration des protéines
• Conditions de purifications génériques : le plus souvent pas d’optimisation
• Rapidité
• Non dénaturante

Désavantages

• Coût (plus particulièrement la protéine A)

Conclusion: c’est la technique de choix pour les anticorps et les protéines recombinantes.

Étapes classiques de la chromatographie par affinité :

Qu’est ce que l’affinité ?

La chromatographie par affinité est fondée sur l’interaction spécifique d’une biomolecule avec son ligand. La séparation est ainsi hautement sélective.
Cette technique de séparation est spéciale puisque basée sur la fonction biologique ou la structure chimique unique d’une bio-molécule. Le ligand est immobilisée sur une résine chromatographique.
Une fois immobilisée sur la résine, et après lavage des impuretés, la molécule est désorbée par modification de la phase mobile.

• Grande sélectivité
• Haute résolution
• Grande capacité

Le degré de purification est très important (X100) et le rendement est excellent.

Un grand nombre d’adsorbant existe pour les protéines naturelles ou recombinantes :

• Protéine A pour les anticorps
• Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) pour les proteins His-tag
• Glutathion pour les protéines GST Tag (Glutathion S Transferase)